产品品牌 | reagen | 生产厂家 | reagen |
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产品性状 | 液态 | 主要成份 | 试剂盒 |
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包装规格 | 96t | 贮存方法 | 2-8° |
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产品有效期 | 12月 | 批准文号 | reagen |
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商品名 | 禽流感病毒H5N1亚型核酸扩增检测试剂盒 |
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禽流感病毒H5N1亚型(AIV-H5N1)核酸扩增检测试剂盒
【名称】
中文名:禽流感病毒H5N1亚型(AIV-H5N1)核酸扩增检测试剂盒
英文名:Avian Influenza Virus Type H5N1 (AIV-H5N1) Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit
【目的】
本试剂盒适用于检测发病动物肺脏等组织、体液或淋巴结等标本以及细胞培养液中禽流感病毒RNA,适用于禽流感病毒感染的辅助诊断及流行病学调查,其检测结果仅供参考。
【原理】
本试剂盒用一对禽流感病毒H5N1亚型特异性引物,用一步法PCR对禽流感病毒H5N1亚型进行体外扩增,产物经凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,紫外灯观察,从而达到快速检测之目的。
【试剂组成】
名 称
数 量
规 格
RNA提取液A
1 瓶
10ml/瓶
RNA提取液B
1 瓶
10ml/瓶
逆转录酶系
1 管
40μl/管
Taq酶系
1 管
40μl/管
AIV-H5 PCR MIX
1 管
800μl/管
AIV-H5阳性质控品
1 管
100μl/管
阴性质控品
1 管
250μl/管
DEPC水
1 管
2000μl/管
【储存条件】打开包装后RNA提取液A、RNA提取液B 4℃保存;其余-20℃保存,避免反复冻融。自备75%乙醇。
【试剂规格及有效期】40头份/盒,有效期12个月。
【标本采集】
1. 适用标本类型:发病动物组织、体液或淋巴结等标本;病毒细胞培养液
2. 标本采集:
2.1 组织:取发病动物肺、肝、脾、肺、肾、淋巴结及胰腺等组织约1g,置入1.5ml洁净EP管,立即送检。
2.2 体液及培养液体:取上述标本约1ml,置入1.5ml洁净EP管,立即送检。
2.3 咽及泄殖腔等试子:用棉试子取咽或泄殖腔分泌物,将试子放入盛有1.0ml PBS的离心管中,立即送检。
【保存和运输】上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃。但不能超过6个月,标本运送应采用0℃冰壶。
【适用仪器】取得资格认证的定性PCR仪。
【使用方法】
1.RNA提取
1.1样品处理
固体组织:取0.5g左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎,加入1.5ml生理盐水继续研磨,待匀浆后转至1.5ml的EP管中,10000rpm离心2min。取上清100μl于1.5ml的EP管中,加入200μl RNA提取液A充分震荡,静置3min。
血清或病毒液:取100μl血清加入200μl RNA提取液A充分震荡,静置3min。
阴性质控品:处理:取100μl阴性质控品加入200μl RNA提取液A充分震荡,静置3min。
1.2.加入200μl RNA提取液B,用力震荡15s,4℃ 13,000rpm离心5min。
1.3.弃上清,加入1ml 75%乙醇,充分混匀,13,000rpm离心5min,小心吸去大部分残留液体。
1.4.将提取管敞口在室温空气中干燥10min,使液体挥发干净,用20μl DEPC水溶解沉淀。
AIV-H5阳性质控品:直接取3μl进行PCR扩增。
2.PCR扩增
从试剂盒中取出AIV-H5 PCR MIX、Taq酶系、逆转录酶系室温融化并振荡混匀后,10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
试剂
AIV-H5 qPCR MIX
逆转录酶系
Taq酶系
用量
20μl
1μl
1μl
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10,000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加入22μl,向每管中加入处理后样品(所获得的RNA样品)或AIV-H5阳性质控品和阴性质控品3μl,10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内,按对应顺序设置阴性质控品,阳性质控品以及未知标本,按照下列条件扩增:
循环条件:42℃→20分钟,后94℃→2分钟, 93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s ,共35个循环。
3.电泳检测
4.1 2%琼脂糖凝胶配制:稀释50×TAE至1×TAE(取20ml50×TAE,加980 ml双蒸水至1L),称4g琼脂糖放于500mL 锥形瓶中,1×TAE 200 ml,置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢),再加入20μl 溴化乙锭(EB)充分混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后使用。
4.2 电泳检测:取PCR 扩增产物10μl,用加样枪点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm 电压,1×TAE中电泳,紫外灯下观察结果。
4. 结果判断
在阴性质控品无带出现(引物带除外),AIV-H5阳性质控品出现162bp 扩增带时,实验结果成立。若被检样品出现162bp 扩增带为禽流感病毒H5N1亚型阳性,否则为阴性。
【注意事项】
1. 使用前请仔细阅读说明书。并且严格按照说明书进行操作。
2. 试剂盒内各种组分使用前应充分融化混匀并经高速短暂离心后试用。
3. 所有使用的离心管、 Tip 头应用DEPC水处理并高压灭菌,而且必须不含 RNase 。
4. 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行,以免污染。
5. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。