产品品牌 | reagen | 生产厂家 | reagen |
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产品性状 | 液态 | 主要成份 | 试剂盒 |
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包装规格 | 96t | 贮存方法 | 2-8° |
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产品有效期 | 12月 | 批准文号 | reagen5472 |
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商品名 | 伪狂犬病毒(PRV)核酸检测试剂盒 |
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伪狂犬病毒(PRV)核酸检测试剂盒
【名 称】
中文名:伪狂犬病毒(PRV)核酸检测试剂盒
英文名:Pseudorabies Virus(PRV)Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit
【目的】
本试剂盒适用于检测猪脑等(以中脑和脑桥病毒含量最高)、扁桃体、肾和脾等标本中伪狂犬病毒(PRV)DNA,适用于伪狂犬病毒(PRV)感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。
【原理】
本试剂盒用一对伪狂犬病毒(PRV)特异性引物和一条特异性荧光探针,经过裂解提取DNA,后者在Taq酶作用下,配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分,通过PCR-荧光探针法对伪狂犬病毒(PRV)DNA进行扩增,从而达到快速检测之目的。
【组成】
名 称
数 量
规 格
核酸提取液
1 管
2ml/管
Taq 酶系
1 管
40μl/管
PRV-qPCR MIX
1 管
840μl/管
PRV-阳性质控品
1 管
50μl/管
阴性质控品
1 管
250μl/管
【储存条件】-20℃保存,避免反复冻融。
【标本采集】
1. 适用标本类型:发病猪脑(以中脑和脑桥病毒含量最高)、扁桃体、肾和脾等组织;病毒细胞培养液
2. 标本采集:
发病猪脑(以中脑和脑桥病毒含量最高)、扁桃体、肾和脾等:无菌条件下取上述组织1g左右,置入1.5ml洁净EP管,立即送检。
血清:无菌条件下取耳缘静脉血1-3ml,置干燥管中,密闭送检。
【保存和运输】上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃。但不能超过6个月,标本运送应采用0℃冰壶。
【适用仪器】取得资格认证的荧光定量PCR仪。
【使用方法】
1.DNA提取
固体组织::取适量固体组织,用生理盐水洗净表面残余血液,转至研磨器中,加1ml生理盐水,研磨成组织匀浆,取50μl转至1.5ml洁净的离心管中,加50μl核酸提取液,充分混匀,100℃处理10min,4℃13,000g离心5min,取上清液3μl做PCR扩增。
血清及病毒液等:直接取50μl转至1.5ml洁净的离心管中,加50μl核酸提取液,充分混匀,100℃处理10min,4℃13,000g离心5min,取上清液3μl做PCR扩增。
2.PCR扩增
从试剂盒中取出PRV-PCR MIX、Taq酶系,室温融化并振荡混匀后,10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
试剂
PRV-qPCR MIX
Taq酶系
用量
21μl
1μl
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10,000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加入22μl,向每管中加入处理后样品或PRV-阳性质控品和阴性质控品3μl,10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内,按对应顺序设置阴性控品,阳性定量标准品以及未知标本,并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件:
ABI PRISM 7700, ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖),ABI PRISM7300/7500(使用8联管),MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器,循环条件:93℃→2分钟,后93℃ 30秒→55℃ 45秒, 40个循环。
LightCycler等使用毛细管的仪器,循环条件:93℃→2分钟,后93℃ 5秒→58℃ 45秒,共40个循环。
3.结果分析判定
反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值(3~8),stop值(13~18)以及Threshold值,使Std curve 窗口下的标准曲线达到最佳(correlation数值介于-0.97~-1之间,correlation数值等同于∣r∣值),最后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值(Qty-Copies/ml)。
【质控标准】
阴性质控品:全部阴性
PRV阳性质控品:阳性质控品的 Ct 值均应小于 35.0。
∣r∣≥0.97(correlation数值介于-0.97~-1之间,correlation数值等同于∣r∣值)。
以上条件应同时满足 ,否则,此次试验视为无效,全部试验应重新进行。
【结果判定】
测定结果的计算:
如果Ct值﹤38,则实验样品的PRV DNA含量(基因拷贝数/ml)= Qty-Copies/ml;
如果38﹤Ct值﹤40,为灰区建议重新检测,重新检测若38﹤Ct值﹤40判为阳性,否则为阴性。
如果Ct值=40,则PRV DNA含量(基因拷贝数/ml)﹤1×10P2PCopies/ml (低于检测下限)。
【注意事项】
初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
所有使用的离心管应高压灭菌,而且必须不含DNA酶。
PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等),防止实验室污染。
样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行,以免污染。
试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。