新城疫病毒（NDV）核酸检测试剂盒

新城疫病毒（NDV）核酸检测试剂盒

【名称】
中文名：新城疫病毒（NDV）核酸检测试剂盒
英文名：Newcastle disease virus Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit


【目的】
本试剂盒适用于检测禽肉、禽类组织脏器、禽类排泄物和分泌物等标本中新城疫病毒（NDV）mRNA，适用于新城疫病毒感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。

【原理】
本试剂盒用一对新城疫病毒特异性引物，结合一条特异性探针，用一步法荧光PCR对新城疫病毒RNA进行体外扩增检测，从而达到快速检测之目的。

【试剂组成】





名 称

数 量

规 格


逆转录酶系

1 管

40μl/管


Taq酶系

1 管

40μl/管


NDV qPCR MIX

1 管

800μl/管


NDV阳性质控品

1 管

100μl/管


阴性质控品

1 管

250μl/管


DEPC水

1 管

2000μl/管
【储存条件】-20℃保存，避免反复冻融。
【试剂规格及有效期】40头份/盒，有效期6个月。

【标本采集】
1. 适用标本类型：禽肉、禽类组织脏器、禽类排泄物和分泌物，培养物等。
2. 标本采集：
2.1 组织：将禽类处死，取心、肝、脾、肺、肾、小肠、鸡肉、胰腺等组织，冻存于-70℃冰箱中，密封送检。
2.2 培养物等液体标本：取组织液1~3ml，转至无菌5ml玻璃管中，密封送检。
2.3咽拭子：用棉拭子取咽喉分泌物，将棉拭子置入盛有1.0 ml PBS的离心管中，密封送检。
2.4泄殖腔拭子：用棉拭子深入泄殖腔转一圈，沾粪便，将棉拭子置入转至盛有1.0 ml PBS的离心管中，密封送检。
2.5血清：用无菌注射器取2~3ml全血，转至无菌5ml玻璃管中，待析出血清后，将血清转至1.5ml的清洁离心管中，密封送检。
【保存和运输】上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。

【适用仪器】取得资格认证的荧光定量PCR仪。

【使用方法】
1．RNA提取
用户可选用商业化试剂盒提取RNA，如Qiagen病毒RNA提取试剂盒,或维伯鑫病毒RNA提取试剂盒（磁珠法）（货号：RR-0128）。
2．PCR扩增




从试剂盒中取出NDV qPCR MIX、Taq酶系、逆转录酶系室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：





试剂

NDV qPCR MIX

逆转录酶系

Taq酶系


用量

20μl

1μl

1μl
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入22μl，向每管中加入处理后样品(所获得的RNA样品)或NDV阳性质控品和阴性质控品3μl，10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性质控品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类(报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA)和循环条件:
ABI7500等使用薄壁管的仪器，循环条件:42℃→20分钟，后94℃→2分钟，后94℃ 30秒→55℃ 45秒，40个循环。
LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件: 42℃→20分钟，94℃→2分钟，后94℃ 5秒→58℃ 45秒， 40个循环。

3. 结果分析判定
反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct 值在40以上，Ct 值小于35个循环的为阳性；Ct 值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct 值仍然在35-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。

【质控标准】
阴性质控品：全部阴性。
NDV -阳性质控品：阳性对照的 Ct 值均应小于 30，且呈标准S型扩增曲线。
以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

【注意事项】
1. 使用前请仔细阅读说明书。并且严格按照说明书进行操作。
2. 试剂盒内各种组分使用前应充分融化混匀并经高速短暂离心后试用。
3. 所有使用的离心管、 Tip 头应用DEPC水处理并高压灭菌，而且必须不含 RNase 。
4. 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
5. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。